血漿樣品

（不能用肝素抗凝）

(1) 用采血針和EDTA抗凝管抽取全血，輕柔上下顛倒混勻后室溫或者4°C保存，并在1小時內進行下一步處理；

(2)  4°C條件下，3000× g離心15min，小心吸取上清，注意避免吸入底部和側面的沉淀物；

(3) 將血漿凍存于-80°C；

提示：送樣量最好4 ml以上（分離4 ml血漿約需要8-10 ml全血）。

>2ml

血清樣品

（有條件的話盡量采用血漿，避免血小板來源的外泌體影響）

(1) 用采血針和普通采血管（不含抗凝劑，10ml規格）采血10 ml；

(2) 室溫靜置 30 min，然后4°C條件下，靜置3-4小時（此時可見血塊析出）；

(3) 用移液器吸取上面的淡黃色血清（應該有4 ml左右）轉入15 ml離心管中，4°C條件下 3000g離心15min，小心取上清轉入新的離心管中；

(4) 將血清樣品置于-80°C保存；

提示：送樣量最好4 ml以上（分離4 ml血清約需要10-15ml全血）。

>2ml

細胞上清

（需采用去除外泌體的培養基）

細胞培養基必須使用去除 exosome的血清或者無血清培養基，以降低背景值的干擾（牛血清中含有大量牛源外泌體）。

(1) 細胞在正常含有血清的培養基中培養一定時間，貼壁細胞密度在70 %-80 %，懸浮細胞密度在60 %-70 %；

(2) 對于貼壁細胞，去除原有培養基，換為新的不含外泌體的培養基或者無血清培養基；對于懸浮細胞，300 g，4°C，10 min收集細胞；

(3) 使用不含外泌體的培養基或者無血清培養基懸浮細胞并繼續培養。細胞繼續培養24-48 小時，根據細胞的生長速度確定收取上清時間；

(4) 收集細胞上清，300 g，4°C，離心10 min；小心吸取上清，注意避免吸入細胞或者細胞碎片；

(5)  3000 g，4°C，再次離心15 min，確保將細胞或者細胞碎片去除干凈；

(6) 上清0.22μm過濾，去除細胞碎片、凋亡小體和微囊泡；

(7) 上清可在4°C短期保存（1-2天），長期保存可凍存于-80°C 。建議細胞上清分離后盡快進行外泌體分離，保存在4°C和-80°C，都會對產量有一定的影響。

>20ml

尿液

(1) 無菌容器采集前/中后段晨尿100ml，并注意避免細菌污染，收集前注意對飲食的控制，于4℃臨時保存（不得超過8 h）；

加入蛋白酶抑制劑混合物（1.67 ml of100mM NaN3, 2.5ml PMSF (2 mg/ml in isopropyl alcohol), 50 μl Leupeptin (1 mg/ml in ddH2O)）；

(2) 并于3000×g離心15min，去除細胞或細胞碎片；

(3)  -80℃冰箱中保存。

>20ml

腦脊液

(1) 收集腦脊液10ml，采集方式為腰椎穿刺，樣本一經分離，請務必立即置于冰上或4℃短暫保存（不得超過4 h）,避免受到血液污染,勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放；

(2)  -80℃冰箱中保存。

10ml

胸水

(1) 臨床收集胸水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；

(2) 將收集到的胸水1000 g離心10 min，收集上清液；

(3) 將得到的胸水上清3000 g離心10 min，收集上清；

(4)  -80℃冰箱中保存。

30ml

腹水

(1) 臨床收集腹水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；

(2) 將采集到的腹水在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除腹水中的殘渣；

(3) -80℃冰箱中保存。

30ml

膽汁

(1) 用無菌容器收集膽汁；

(2) 將收集到的膽汁在4℃下，3000 g離心10 min去除細胞沉渣和碎片；

(3) 收集膽汁上清液，4℃或者-20℃長期保存。

5ml